เครื่องหมายดีเอ็นเอใช้ปรับปรุงพันธุ์กุ้งกุลาดำ
12/9/2546
15:26:49, by สุวิทย์
วุฒิสุทธิเมธาวี
Microsatellites
เครื่องหมายดีเอ็นเอสำหรับใช้ในการปรับปรุงพันธุ์กุ้งกุลาดำ
Microsatellites as DNA markers for genetic
improvement in black tiger shrimp
(Penaeus monodon Fabricius).
สุวิทย์
วุฒิสุทธิเมธาวี
ห้องปฏิบัติการ
DNA Technology,
ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ
กุ้งกุลาดำเป็นผลผลิตจากการเลี้ยงที่มีความสำคัญระดับหนึ่งของโลก
ได้มีการพัฒนาเป็นอุตสาหกรรมและขยายตัวอย่างรวดเร็ว
ผลผลิตทั้งหมดที่ได้ส่วนใหญ่ได้จากการใช้พ่อแม่พันธุ์ที่จับได้จากทะเลอย่างต่อเนื่องจนในปัจจุบันหายากลงไปทุกขณะ
นอกจากนี้ยังพบปัญหาการเลี้ยงที่เกิดขึ้นและกระจายไปสู่ที่ต่าง
ๆ อย่างรวดเร็ว
เช่น
โรคที่เกิดจากเชื้อแบคทีเรีย
ไวรัส
และเชื้อราตลอดจนปัญหาที่เกิดจากสิ่งแวดล้อมเสื่อมโทรม
การปรับปรุงพันธุ์คือทางเลือกหนึ่งที่จะช่วยให้ธุรกิจการเพาะเลี้ยงกุ้งกุลาดำเป็นธุรกิจที่ยั่งยืนได้
โครงการปรับปรุงพันธุ์กุ้งกุลาดำหลายโครงการได้มีความพยายามในการคัดเลือกพ่อแม่พันธุ์กุ้งที่มีลักษณะดีเป็นเลิศในด้านต่าง
ๆ เช่น
เจริญเติบโตดี,
ต้านทานโรคตลอดจนสามารถปรับตัวให้เข้ากับสภาพแวดล้อมได้ดีสำหรับใช้ผลิตลูกกุ้ง
นอกจากนี้ยังได้มีการใช้โมเลกุลเครื่องหมายในการคัดเลือกพันธุ์ซึ่งจะช่วยให้สามารถคัดเลือกพันธุ์ได้รวดเร็วจากการใช้เทคโนโลยีที่ทันสมัยและเป็นการคัดเลือกในระดับสารพันธุกรรม
โมเลกุลเครื่องหมายที่ได้มีการพัฒนาและใช้ในการศึกษาพันธุกรรมกุ้งในกลุ่ม
Penaeids ได้แก่ Type I marker
เช่น allozymes และ restriction
fragment length polymorphisms (RFLP)
ของ expressed genes (cDNA, ESTs)
และ Type II marker เช่น RAPD,
AFLP, mini-and microsatellites (Garcia et
al., 1994 ; 1996 ; Garcia and
Alcivar-Warren, 1996 ; Vanavichit et al ;
1996 ; Bagshaw and Buckholt, 1997 ; Dhare
and Alcivar - Warren, 1997, Wolfus et al ;
1997 ; Moore et al ; 1999)
Microsatellites หรือ Simple sequence
length polymorphism (SSLP) คือ
satellite DNA ที่ core sequences
ประกอบด้วย 1-6 เบส
โดยมีจำนวนซ้ำตั้งแต่
2
ขึ้นไปกระจายทั่วจีโนม
เป็นโมเลกุลเครื่องหมายที่มีประโยชน์มากดังนี้
คือ
1. highly informative
โดยเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอ
ที่ให้ความแตกต่างสูง
และแสดงให้เห็นสภาพข่มร่วมกันของยีน
(codominant)
2. technically simple คือ
สามารถทำได้ง่าย
โดยใช้เทคนิค PCR
ซึ่งต้องการปริมาณดีเอ็นเอเริ่มต้นเพียงเล็กน้อย
3. highly abundant คือ
พบกระจายทั่วจีโนม
ทั้งระหว่างยีน
และภายในยีน
4. readily transferable คือ primer
ที่จำเพาะในแต่ละตำแหน่งของ
microsatellite markers
สามารถใช้ได้โดยทั่วไปเพียงแค่มีลำดับเบสของไพรเมอร์
5. flexible คือ
เป็นเครื่องหมาย
1
ดีเอ็นเอที่ใช้ประโยชน์ได้หลายอย่าง
ได้แก่ gene evolution
phylogenetic relationship, genetic mapping,
DNA fingerprinting, physical mapping
และ gene cloning เป็นต้น
และมีข้อด้อยคือ
1.
ค่าใช้จ่ายสูงในการพัฒนา
โดยเฉพาะสิ่งมีชีวิตที่ยังไม่เคยมีข้อมูลลำดับเบสใน
GENBANK
2.
วิเคราะห์ผลยากถ้าต้องการรู้ขนาด
allele
ที่แน่นอนเนื่องจากการเกิด
"stutter band"
3.
ถ้าตำแหน่งใดเป็น
tetranucleotide repeats
จะไม่พบกระจายทั่วจีโนมแต่จะกระจุกอยู่บริเวณ
centomeres หรือ telomeresในกุ้งกุลาดำได้พัฒนา
microsatellite markers
ขึ้นโดยมีวัตถุประสงค์เพื่อใช้เป็นเครื่องมือในการติดตามและศึกษาพันธุกรรมกุ้งกุลาดำ
โดยเฉพาะอย่างยิ่งการนำมาใช้ในการปรับปรุงพันธุ์กุ้งกุลาดำให้ได้พันธุ์กุ้งที่มีคุณลักษณะเหมาะสมต่อการเลี้ยงในสภาพต่าง
ๆ ได้อย่างดี
ในปัจจุบันได้มีการใช้ประโยชน์จาก
microsatellite markers
ในส่วนต่าง ๆ
ได้แก่
ใช้ในการจับคู่ผสมพันธุ์
การติดตามกลุ่มพ่อแม่ลูกและการแยกความแตกต่างระหว่างครอบครัวกุ้งเป็นต้น
Microsatellite
markers
ได้ถูกนำมาใช้ในการจัดการพ่อแม่พันธุ์กุ้งกุลาดำโดยใช้เป็นโมเลกุลเครื่องหมายสำหรับติดฉลากตัวกุ้งและคัดเลือกพ่อแม่พันธุ์
โดยการใช้ประโยชน์สามารถเริ่มจากการศึกษา
allele sharing
ของพ่อแม่พันธุ์ที่ได้จากทะเลแต่ละตัวเพื่อป้องกันไม่ให้เกิดการผสมพันธุ์ระหว่างพี่น้อง
หลังจากวิเคราะห์ผลแล้วก็จับคู่ผสมนอกจากนี้ในทุกช่วงของการจับคู่ผสม
ซึ่งพ่อแม่พันธุ์อาจจะได้จากการเลี้ยงในบ่อก็สามารถใช้
microsatellite markers
ในการตรวจสอบความสัมพันธ์ทางเครือญาติได้ก่อนการจับคู่ผสมพันธุ์
ในการผสมพันธุ์ของกุ้งกุลาดำโดยทั่วไปจะจัดให้มีพ่อแม่พันธุ์กุ้งหลายตัวในบ่อเดียวกันซึ่งมีโอกาสผสมพันธุ์ได้ดีกว่าแยกเป็นคู่
ๆ
เนื่องจากความพร้อมของกุ้งแต่ละตัวอาจแตกต่างกันโดยเราไม่สามารถทราบได้ว่าตัวใดมีความพร้อมเหมือนกัน
ซึ่งก็ได้มีการนำ
microsatellite markers
มาใช้ในการตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูกของกุ้งเพื่อให้เกิดความรวดเร็วและลดความยุ่งยากในการจัดระบบผสมพันธุ์
วิธีการตรวจสอบสามารถทำได้โดยการเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อพ่อแม่พันธุ์ทุกตัวมาสกัดดีเอ็นเอแล้วแยกความแตกต่างแต่ละตัวด้วย
microsatellite markers
หลังจากที่แม่กุ้งวางไข่และไขฟักเป็นตัวก็จะสุ่มลูกกุ้งมาตรวจสอบว่าเป็นลูกที่เกิดจากพ่อแม่ใด
โดยดูได้จาก allele
ที่เกิดขึ้นในลูก
เนื่องจากลูกจะได้รับการถ่ายทอดสารพันธุกรรมจากพ่อและแม่ฝ่ายละครึ่ง
เช่น ลูกมี 2 allele
ประกอบด้วย
หนึ่ง allele
ได้จากและอีกหนึ่ง
allele ได้จากแม่
หลังจากนั้นก็ดูว่า
allele
ที่เกิดขึ้นได้รับการถ่ายทอดมาจากพ่อแม่ตัวใด
นอกจากนี้ยังสามารถตรวจสอบได้แม้ว่าจะพิจารณาจากแม่เพียงตัวเดียว
และได้มีการพัฒนาวิธีการตรวจสอบพ่อแม่ลูกตั้งแต่ลูกก็ยังอยู่ในระยะ
nauplius ซึ่งพบว่า
nauplius 1 ตัว
สามารถสกัดดีเอ็นเอที่เพียงพอสำหรับการตรวจสอบด้วย
microsatellite markers
นอกจากนี้ในการคัดพันธุ์โดยวิธี
Family selection
อาศัยการเลี้ยงกุ้งที่ได้จากการจับคู่ผสมรวมกันในบ่อเดียวกันเพื่อเปรียบเทียบการเจริญเติบโตของกุ้งแต่ละครอบครัวภายใต้สภาพแวดล้อมเดียวกัน
และจะคัดเลือกกุ้งที่ต้องการจากครอบครัวที่มีการเจริญเติบโตดีที่สุดสำหรับใช้เป็นพ่อแม่พันธุ์
ในระหว่างเลี้ยงนั้นจะมีการสุ่มตัวอย่างกุ้งในบ่อขึ้นมาเพื่อศึกษาการเจริญเติบโตและสามารถตัดขาว่ายน้ำกุ้งเพื่อนำไปศึกษาดีเอ็นเอและแยกความแตกต่างระหว่างครอบครัวโดยใช้
microsatellite markers
ซึ่งสามารถใช้เป็นข้อมูลสำหรับเปรียบเทียบการเจริญเติบโตในแต่ละครอบครัวได้
เอกสารอ้างอิง
Bagshaw
J. and M. Bucholt. 1997. A novel satellite /
miorosatellite combination in the genome of
the marine shrimp, Penaeus vannamei. Gene
184 : 211 - 214.
Benzie, J.A.K., E. Ballment and S. Frusher.
1993. Genctic structure of Penaeus monodon
in Australia : concordant results from mt
DNA and allozymes. Aquaculture 111 : 89 -
93.
Bouchon, D., c. Souty - Grosset and R.
Raymond. 1994. Mitochondrial DNA variation
and markers of species identity in two
penaeid shrimp species : Penaeus monodon
Fabricius and P. japonicus Bate. Aquaculture
127 : 131 - 144.
Dhar, A. K. and A. Alcivar - Warren. 1997.
Generation of expressed sequence tags (ESTs)
from muscle DNA library of shrimp (Penaeus
vannamei). Joint Plant & Animal Genome
Mapping conference, San Diego, CA., Janise
1997. Abet 503.
Garcia, D. K. and J. A. H. Benzie. 1995.
RAPD markers of potential use in penaeid
prawn (Penaeus monodon) breeding programs.
Aquaculture 130 : 137 - 144.
Moore, S. S., V. Whan, G. P. Danis, K.
Byrne, D. J. S. Hetzel and W. Preston, 1999.
The development and application of genetic
markers for kuruma prawn Penaeus japonicus.
Aquaculture 173 : 19 - 32.
Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis.
1989. Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Cold springs Harbor Laboratory
Press.
Vanavichit, A., S. Wuthisuthimethavee, P.
Lumubol and S. Tragoonrung. 1996.
Identification of prawn species in Thailand
using different DNA markers. 8 th Annual
Meeting of Thai Society for Biotechnology,
Nov, 14 - 15, 1996, Prajuab Khiri Khan,
Thailand.
Weising, K., R. W. M. Fung, D. J. Keeling,
R. G. Atkinson and R. C. Gardner. 1996.
Characterization of microsatellites from
Actinidia chinensis. Molecular Breeding 2 :
117 - 131.
Wolfus, G. J., D. K. Garcia and A. Alcivar
Warren. 1997. Application of microsatellite
technique for analyzing genetic diversity in
shrimp breeding programs. Aquaculture 152 :
35 - 47.
Wuthisuthimethavee, S. 1999. DNA Marker
Technologies for Biodiversity study in
shrimp. M. S. Thesis (Fisheries Science),
Graduate School, Kasetsart Univ. Thailand.
101 p.
จากหนังสือเสวนาวิชาการเรื่อง
กุ้ง
ภาควิชาวิทยาศาสตร์ทางทะเล
คณะประมง
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์
รศ.ประจวบ
หลำอุบล |
