เทคนิค PCR ในการเพิ่มจำนวน DNA และวินิจฉัยโรคบางชนิด ดี เอ็น เอ คลัง ข้อ มูล พันธุ กรรม ดี เอ็น เอ หรือ Deoxyribonucleic (DNA) เป็น สาร พันธุ กรรม ทำ หน้า ที่ ควบ คุม และ ถ่าย ทอด ลักษณะ ต่าง ๆ ของ สิ่ง มี ชีวิต โดย ดี เอ็น เอ จะ ประกอบ ด้วย หน่วย ย่อย พื้น ฐาน ที่ เรียก ว่า “นิวคลี โอ ไทด์ ” อัน เป็น ชุด ของ โมเลกุล ฟอสเฟต น้ำ ตาล เพนโตส และ สาร เคมี ที่ มี สมบัติ เป็น ด่าง หรือ “เบส” 1 ตัว ซึ่ง เบส จะ มี อยู่ 4 ชนิด คือ adenine (A) , guanine (G) , cytosine (C) , thymine (T)ลักษณะ โครง สร้าง ของ ดี เอ็น เอ ประกอบ ขึ้น จาก สาย ชุด นิวคลี โอ ไทด์ 2 สาย ที่ มา พัน เข้า ด้วย กัน เป็น ลักษณะ เกลียว คู่ หรือ บันได เวียน โดย มี เบส ที่ เรียง ราย อยู่ ตาม สาย แต่ ละ สาย แต่ ละ สาย ทำ หน้า ที่ ยึด จับ ระหว่าง สาย ทั้ง สอง และปรากฏว่า สาย ส่วน ที่ มี เบส A จะ จับ คู่ สร้าง พันธะกับเบส T และ ส่วน ที่ มี เบส G จะ จับ คู่ เบส C ซึ่ง การ จับ คู่ กัน นี้ เรียก ว่า เป็น เบส คู่ สม (ดัง แสดง ใน ภาพ ที่ 1) และ แต่ ละ ส่วน บน สาย ดี เอ็น เอ นี้ เอง ที่ เป็น ที่ อยู่ ของ “ยีน” (gene) ซึ่ง เป็น ส่วน ที่ บรรจุ ข้อ มูล สำหรับ การ สร้าง โปรตีน ชนิด ใด ชนิด หนึ่ง โดย ยีน ที่ ต่าง กัน ก็ จะ มี ตำแหน่ง ที่ อยู่ และ การ เรียง ลำ ดับ ของ เบส บน ตัว มัน แตก ต่าง กัน ไป อาร์เอ็น เอ สามารถ เป็น แหล่ง ข้อ มูล พันธุ กรรม ได้ ใน ปี พ.ศ . 2513 ได้ มี ผู้ ค้น พบ ว่า เชื้อ ไวรัส บาง ชนิด มี สาร พันธุ กรรม เป็น อาร์เอ็น เอ RNA หรือ Ribonucleic acid) ซึ่ง ไวรัส สา มาร ลอก รหัส จาก อาร์เอ็น เอ เป็น ดี เอ็น เอ เพื่อ ใช้ ใน การ เพิ่ม จำนวน ไวรัส ใน เซล ล์เจ้า บ้าน ได้ ตัว อย่าง ไวรัส ที่ มี สาร พันธุ กรรม เป็น อาร์เอ็น เอ ได้ แก่ เชื่อ ไวรัส เอชไอ วี ซึ่ง เป็น สาเหตุ ของ โรค เอดส ์ โดย ปกติ อาร์เอ็น เอ จะ ถูก ลอก รหัส มา จาก ดี เอ็น เอ เพื่อ ใช้ ใน การ ถอด รหัส สร้าง โปรตีน เป็น การ ถ่าย ทอด รหัส ทางพันธุ กรรม ออก มา เป็น ลักษณะ ภาย นอก ของ สิ่ง มี ชีวิตอาร์เอ็น เอ ประกอบ ด้วย นิวคลี โอ ไทด์ที่ คล้ายกับดี เอ็น เอ แต่ มี ความ แตก ต่าง ใน ส่วน ของ น้ำ ตาล เพนโตสซึ่ง ใน ดี เอ็น เอ เป็น น้ำ ตาล deoxyribose ส่วน ใน อาร์เอ็น เอ เป็น ชนิด ribose และ เบส ที่ พบ ใน อาร์เอ็น เอ จะ ประกอบ ด้วย เบส 4 ชนิด เช่น กัน โดย มี เบส 3 ชนิด ที่ เหมือนกับดี เอ็น เอ คือ A, G, C และ เบส ที่ ต่างกับดี เอ็น เอ คือ uracil (U) ซึ่ง u จะ จับ คู่กับเบส A (แทน เบส T ใน ดี เอ็น เอ) โครโมโซม สาร DNA ซึ่ง เป็น ข้อ มูล พันธุ กรรม ของ สิ่ง มี ชีวิต จะ มี ขนาด ยาว แตก ต่าง กัน มาก ใน กรณี ของ เชื้อ ไวรัส อาจ มีจีโนม (genome) หรือ ข้อ มูล พันธุ กรรม ทั้ง หมด เป็น DNA หรือ RNA เท่า นั้น และ อาจ เป็น สาย คู่ หรือ สาย เดี่ยว ที่ เป็น เส้น ยาว (linear) วง แหวน (circular) หรือ เป็น ชิ้น แยก กัน (segments) ซึ่ง ต่าง จากจีโนม ของ แบคทีเรีย และ สิ่ง มี ชีวิต ชั้น สูง ซึ่ง จะ เป็น โปรตีน ร่วมกับกัน อยู่กับสาย DNA และ มี รูป ร่าง ที่ เด่น ชัด ซึ่ง เรียก ว่า โครโมโซม (chromosome) (ภาพ ที่ 2) เชื้อ แบคทีเรีย จะ มี โครโมโซม ประกอบ ด้วย DNA สาย เกลียว คู่ ชนิด วง แหวน จับ รวม อยู่กับโปรตีน หลาย ชนิด เป็น กลุ่ม เรียก ว่า นิวคลี ออยด์ (nucleoid) แต่ จะ ไม่ มี เยื่อ หุ้ม นิวเคลียส ห่อ หุ้มใน สิ่ง มี ชีวิต ชั้น สูง สาย DNA จะ อยู่ ใน ลักษณะ ที่ จับ รวมกับฮีสโตน (histone) และ โปรตีน ชนิด อื่นๆ โดย มี การ พัน และ หด ตัว ของ สาย DNA เพื่อ ให้ สามารถ บรรจุ เข้า ใน ส่วน นิวเคลียส ของ เซลล์ ได้ นอก จาก นิวเคลียส แล้ว ใน สิ่ง มี ชีวิต ชั้น สูง ยัง มี ยีน ที่ อยู่ ใน ส่วน ของ organelle อื่นๆ เช่น ใน พืช จะ มี ยีน อยู่ ในไมโต คอนเดรีย (mitochondria) และ คลอ โรพลาส (chloroplast) อีก ส่วน หนึ่ง เป็น ต้น เทคนิค Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction หรือ (PCR) เป็น เทคนิค สำหรับ เพิ่ม ปริมาณ ดี เอ็น เอ โดย อาศัย หลัก การ DNA Replication ซึ่ง เป็น การ สังเคราะห์ สาย ดี เอ็น เอ สาย ใหม่ จาก ดี เอ็น เอ ต้น แบบ ใน หลอด ทด ลอง ภาย ใน ระยะ เวลา อัน สั้น และ ได้ ดี เอ็น เอ สาย ใหม่ เกิด ขึ้น เป็นล ้านเท่า เทคนิค นี้ พัฒนา ขึ้น เมื่อ ปี พ.ศ. 2528 โดย Kary Mullis และ คณะ แห่ งบ ริษัท Cetus Corporation จุด เด่น ของ เทคนิค PCR คือ สามารถ เพิ่ม ปริมาณ ดี เอ็น เอ ได้ อย่าง เฉพาะ เจาะ จง โดย มี ขั้น ตอน การ ทำ งาน น้อย และ ใช้ เวลา น้อย จน ถึง ปัจจุบัน นี้ เทคนิค PCR ได้ รับ การ ปรับ ปรุง และ พัฒนา ใน หลาย ๆ ด้าน จน กระทั่ง ได้ รับ การ ยอม รับ ว่า เป็น เทคโนโลยี ที่ สำคัญ มาก ต่อ งาน ด้าน อณู ชีวโมเลกุล สามารถ นำ ไป ใช้ ประ โยชน์ ได้ ทั้งกับงาน วิจัย ทางชีวโมเลกุล และ พันธุ วิศวกรรม เช่น การ เพิ่ม ปริมาณ ยีน (gene cloning) การ วิเคราะห์ ลำ ดับ เบส ของ ยีน (gene sequencing) การ สร้าง ดี เอ็น เอ ติด ตาม (DNA probe) และ การ วิจัย ประยุกต์ เช่น การ ศึกษา การ แสดง ออก ของ ยีน จาก mRNA การ สร้าง ยีน กลาย พันธุ์ (in vitro mutagenesis) การ บ่ง ชี้ ตำแหน่ง กลาย พันธุ์ บน ยีน (point mutations and deletions) เป็น ต้น หลักการของ PCR ใช้ หลัก การ พื้น ฐาน ใน การ สังเคราะห์ ดี เอ็น เอ สาย ใหม่ จาก สาย ดี เอ็น เอ ที่ เป็น ต้น แบบ หนึ่ง สาย ด้วย เอนไซม์ DNA poloymerase ซึ่ง ใช้ กัน อยู่ ทั่ว ไป ใน การ ติด ฉลาก ดี เอ็น เอ และ การ ศึกษา วิเคราะห์ ลำ ดับ เบส แต่ PCR สามารถ สังเคราะห์ ดี เอ็น เอ ได้ คราวละ 2 สาย พร้อม กัน โดย ใช้ ไพรเมอร์ (primer) 1 คู่ ปฏิกิริยา PCR มี 3 ขั้น ตอน และ หมุน เวียน ต่อ เนื่อง กัน ไป ภาย ใต้ สภาวะ ที่ เหมาะ สม ของ แต่ ละ ขั้น ตอน ขั้น แรก เรียก ว่า denaturing เป็น การ แยก สาย ดี เอ็น เอ ที่ เป็น ต้น แบบ จาก สภาพ ที่ เป็น เส้น คู่ ให้ เป็น เส้น เดี่ยว โดย ใช้ อุณหภูมิ สูง 92-95o ซ ขั้น ที่ สอง เรียก ว่า annealing เป็น ขั้น ตอน ที่ ลด อุณหภูมิ ลง และ จัด ให้ไพรเมอร์ ซึ่ง เป็น ดี เอ็น เอ สาย สั้น ๆ (ประกอบ ด้วย นิวคลี โอ ไทด์จำนวน 14-13 เบส) ที่ มี ลำ ดับ เบส เป็น คู่ สมกับดี เอ็น เอ ที่ เป็น ต้น แบบ จับ คู่ กัน ซึ่ง นิยม ใช้ อุณหภูมิ ใน ช่วง 37-60o ซ ขั้น ที่ 3 เรียก ว่า extension เป็น ขั้น ตอน การ สังเคราะห์ ดี เอ็น เอ สาย ใหม่ โดย สังเคราะห์ ต่อ จาก ส่วน ปลาย 5 ของ ไพรเมอร์ ตาม ข้อ มูล บน ดี เอ็น เอ ที่ เป็น ต้น แบบ แต่ ละ สาย โดย อาศัย การ ทำ งาน ของ เอ็น ไซม์ดี เอ็น เอ โพ ลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่ง เอ็น ไซม์นี้ สามารถ ทำ งาน ได้ ดี ที่ สุด ที่ อุณหภูมิ 72-75o ซ เอนไซม์ ดี เอ็น เอ โพ ลิเมอเรส ที่ ใช้ ควร จะ คง คุณสมบัติ อยู่ ได้ ภาย ใต้ สภาวะ ของ ปฏิกิริยา ตลอด ทั้ง สาม ขั้น ตอน จาก ขั้น ตอน ที่ 1-3 ซึ่ง นับ เป็น จำนวน 1 รอบ (one cycle) จะ ให้ ผล ผลิต เป็น ดี เอ็น เอ สาย คู่ ที่ มี ลำ ดับ เบส เป็น คู่ สมกับดี เอ็น เอ ที่ เป็น ต้น แบบ เพิ่ม ขึ้น เป็น สอง เท่า เมื่อ จัด ให้ เกิด ปฏิกิริยา ลูก โซ่ จาก ขั้น ที่ 1 ถึง 3 หมุน เวียน ไป อีก หลาย ๆ รอบ จะ เพิ่ม ปริมาณ ดี เอ็น เอ ได้ มาก มาย ประมาณ ว่า ปฏิกิริยา 20 รอบ สามารถ เพิ่ม ปริมาณ สาร ดี เอ็น เอ ไม่ ได้ น้อย กว่า 100,000 เท่า สาร เคมี ที่ เกี่ยว ข้อง ใน ปฏิกิริยา PCR เนื่อง จาก การ ทำ PCR เป็น การ สร้าง สาย ดี เอ็น เอ สาย ใหม่ ใน หลอด ทด ลอง จึง ต้อง มี การ เติม สาร เคมี และ สาร ตั้ง ต้น ที่ เกี่ยว ข้อง เพื่อ ใช้ ใน การ นำ มาส ร้าง เป็น ดี เอ็น เอ สาย ใหม่ สาร เคมี ที่ ต้อง ใช้ ปฏิกิริยา PCR มี ดัง ต่อ ไป นี้  Deoxynucleotides (dNTPs) เป็น นิวคลี โอ ไทด์ ซึ่ง เป็น หน่วย ย่อย สำหรับ นำ ไป สังเคราะห์ ดี เอ็น เอ สาย ใหม่  DNA polymerase เป็น เอนไซม์ สำหรับ สังเคราะห์ ดี เอ็น เอ ให้ ช่วย เร่ง ปฏิกิริยา เชื่อม ต่อ นิวคลี โอ ไทด์ใหม่ เข้ากับไพรเมอร์  Primer เป็น ดี เอ็น เอ เริ่ม ต้น สาย สั้น ๆ ที่ มี ลำ ดับ เบส เป็น คู่ สมกับดี เอ็น เอ ที่ เป็น ต้น แบบ ของ การ สังเคราะห์ ใน การ ทำ PCR จึง ต้อง ทราบ ลำ ดับ เบส ของ ดี เอ็น เอ ที่ ต้อง การ จะ เพิ่ม จำนวน เพื่อ ใช้ ใน การ สร้าง ไพเมอร์จำเพาะ  PCR buffer เป็น สาร ละ ลาย ที่ ควบ คุม สภาวะ ของ การ ทำ ปฏิกิริยา ให้ เหมาะ สม เช่น pH และ เกลือ ต่าง ๆ ซึ่ง จะ ต้อง มี อนุมูล แมกนีเซียม (Mg++) อยู่ ด้วย  Template คือ ดี เอ็น เอ ต้น แบบ หรือ ยีน ส่วน ที่ ต้อง การ เพิ่ม ปริมาณ หรือ เป็น ตัว อย่าง ดี เอ็น เอ ที่ ต้อง การ นำ มา ตรวจ หา ดี เอ็น เอ จำเพาะ สาร เคมี ที่ เป็น ส่วน ผสม ของ ปฏิกิริยา PCR จะ ผสม กัน ไว้ ใน หลอด ทด ลอง เล็ก ปริมาตร สาร 20-100 ไมโคร ลิตร เมื่อ นำ หลอด ส่วน ผสม ไป ใส่ ไว้ ในเครื่องควบ คุม อุณหภูมิ ที่ เรียก ว่า DNA thermal cycler (นิยม เรียก ว่าเครื่อง Pcr) ที่ ปรับ อุณหภูมิ ได้ ตาม โปรแกรม ที่ กำหนด จะ เกิด การ สังเคราะห์ ดี เอ็น เอ สาย ใหม่ ขึ้น ใน หลอด เมื่อ เกิด ปฏิกิริยา จน ครบ รอบ และ ระยเวลา ที่ กำหนด จะ ได้ ผล ผลิต ดี เอ็น เอ ขนาด ที่ ต้อง การ เป็น จำนวน มาก เครื่องเพิ่ม ปริมาณ ดี เอ็น เอ (PCR machine) เครื่อง Thermal cycler หรือ PCR machine เป็นเครื่องที่ จำ เป็น ใน การ ทำ PCR ซึ่งเครื่องนี้ มี อยู่ หลาย แบบ และ หลาย ระบบ ขึ้นกับการ ออก แบบ และ การ คิด ค้น ของ บริษัท ผู้ ผลิต ข้อ สำคัญ คือ ต้อง สามารถ ปรับ เปลี่ยน อุณหภูมิ ได้ เป็น ขั้น ตอน ตาม ที่ ตั้ง ไว้ และ ทำ งาน หมุน เวียน กัน หลาย ๆ รอบ ได้ ตั้ง โปรแกรม การ ทำ งาน ได้ และ การ เปลี่ยน แปลง อุณหภูมิ ใน แต่ ละ ขั้น ตอน ใช้ ระยะ เวลา ไม่ นาน นัก ระยะ เวลา ที่ ใช้ แต่ ละ ขั้น คือ denaturing annealing และ extension อยู่ ใน ช่วง 15 วินาที ถึง 10 นาที ดัง นั้น การ เพิ่ม ปริมาณ ดี เอ็น เอ โดย วิธี PCR 25-40 รอบ จะ ใช้ เวลา ประมาณ 1.5-5 ชั่ว โมง การ วิเคราะห์ ผล ผลิต ดี เอ็น เอ จาก ปฏิกิริยา PCR ดี เอ็น เอ ที่ เกิด จาก ปฏิกิริยา PCR ใน หลอดทลอง จะ ไม่ สามารถ มอง เห็น ด้วย ตา เปล่า ได้ ดัง นั้น เพื่อ ตรวจ หา ดี เอ็น เอ ผล ผลิต จะ ต้อง นำ ตัว อย่าง ที่ ทำ PCR มา แยก หา ดี เอ็น เอ โดย ใช้ เทคนิค ที่ เรียก ว่า agarose gel electrophoresis ซึ่ง เป็น การ แยก ดี เอ็น เอ ด้วย กระแส ไฟ ฟ้า บน แผ่น วุ้น (Agarose gel) โดย ระยะ ทางที่ ดี เอ็น เอ สามารถ เคลื่อน ที่ ไป ได้ จะ ขึ้น อยู่กับขนาด ของ ดี เอ็น เอ และ กระแส ไฟ ฟ้า ที่ ใช้ ดี เอ็น เอ ที่ แยก โดย วิธี นี้ สามารถ มอง เห็น ได้ เมื่อ ย้อม ด้วย สี พิเศษ ซึ่ง จะ เรือง แสง เมื่อ เจอกับแสง อุตร้า ไว โอ เลต ซึ่ง จะ เห็น แถบ ดี เอ็น เอ เรือง แสง บน แผ่น วุ้น (ภาพที่ 4) ประ โยชน์ ของ PCR ใน การ ตรวจ วินิจฉัย โรค ปัจจุบัน นี้ นับ ได้ ว่า PCR เป็น เทคนิค สำคัญ มาก ใน งาน อณู ชีวโมเลกุล ทั้ง ที่ เป็น งาน พื้น ฐาน ใน ห้อง ปฏิบัติ การ ไป จน ถึง การ ประยุกต์ ใช้ ทางการ แพทย์ และ การ เกษตร สามารถ ใช้ ใน การ วินิจฉัย โรค ต่าง ๆ ทั้ง โรค ติด เชื้อ และ โรค จาก พันธุ กรรม ศึกษา ความ ผัน แปรหรือ กลาย พันธุ์ ของ พันธุ กรรม หรือ ยีน ทำ แผน ที่ ยีน และ ศึกษา ลำ ดับ เบส ของ ยีน ของ สิ่ง มี ชีวิต ได้ ทุก ชนิด ทั้ง นี้ เนื่อง มา จาก เทคนิค นี้ สามารถ เพิ่ม จำนวน ดี เอ็น เอ ที่ สน ใจ ศึกษา ให้ มี ปริมาณ มาก ใน เวลา อัน รวด เร็ว และ เป็น เทคนิค ที่ ทำ ได้ ง่าย ประ โยชน์ ของ PCR ทางด้าน การ แพทย์ ได้ แก่ การ ตรวจ วินิจฉัย โรค โดย การ ตรวจ หา เชื้อ ไวรัส หรือ แบคทีเรีย ที่ เป็น สาเหตุ ของ โรค (เช่น โรค เอดส์ ,วัณ โรค ,มาเลเรีย) การ ตรวจ หา ยีน ก่อ มะเร็ง (เช่น มะเร็ง เต้า นม ,มะเร็ง ลำ ไส้ ใหญ่) ซึ่ง ประ โยชน์ ของ PCR ทางการ แพทย์ เหล่า นี้ ทำ ให้ การ วินิจฉัย โรค เพื่อ ป้อง กัน และ รักษา เป็น ไป อย่าง มี ประ สิทธิ ภาพ มาก ยิ่ง ขึ้น ทางด้าน การ เกษตร PCR มี บท บาท มาก ใน งาน ด้าน การ ปรับ ปรุง พันธุ์ พืช การ ตรวจ สอบ สาย พันธุ์ พืช การ ตรวจ วินิจฉัย โรค สาย พันธุ์ พืช ต้าน ทาน โรค การ ศึกษา ความ สัมพันธ์ ระหว่าง พืชกับเชื้อ โรค รวม ทั้ง ศึกษา ยีนกับตัว อื่น ๆ ของ พืช และ เชื้อ โรค และ การ แสดง ออก ของ ยีน เหล่า นั้น ได้ ซึ่ง เทคนิค PCR นี้ ช่วย ให้ เข้า ใจ ถึง พันธุ กรรม ของ เชื้อ โรค พืช และ พืช อาศัย ตลอด จน การ นำ ไป ใช้ ใน การ ป้อง กัน กำจัด โรค พืช ที่ เกิด จาก เชื้อ รา แบคทีเรีย และ ไวรัส หรือ เชื้อ สาเหตุ โรค อื่น ๆ ขณะ นี้ เทคนิค PCR ได้ ถูก นำ มา ใช้ ใน อุตสาหกรรม เพาะ เลี้ยง กุ้ง ซึ่ง เป็น อุตสาหกรรม ส่ง ออก ที่ ทำ ราย ได้ ให้กับประเทศ ไทย 4-5 หมื่น ล้าน บาท ต่อ ปี แต่ ใน ปัจจุบัน นี้ เกษตร กร เริ่ม ประสบ ปัญหา จาก โรค ระบาด ใน บ่อ เลี้ยง กุ้ง ซึ่ง มี ผล ต่อ ผล ผลิต กุ้ง ส่ง ออก ทำ ให้ ประเทศ ไทย สูญ เสีย ราย ได้ ถึง ปี ละ 1-2 หมื่น ล้าน บาท สาเหตุ ของ โรค ระบาด ใน กุ้ง ที่ พบ ส่วน ใหญ่ เกิด จาก เชื้อ ไวรัส ซึ่ง ต้อง ใช้ เทคนิค PCR ใน การ ตรวจ สอบ ทำ ให้ สามารถ ป้อง กัน การ แพร่ ระบาด ของ โรค ได้ ทัน ท่วงที นอก จาก นี้ การ คัด เลือก สาย พันธุ์ กุ้ง ที่ ดี เพื่อ ใช้ ใน การ ผสม พันธุ์ ซึ่ง มี ความ แปรปรวน พัน ธุกรรม (genetic diversity หรือ Variation) สูง จะ ไม่ สามารถ ดำ เนิน ไป ได้ ถ้า ไม่ ใช้ วิธี การ คัด เลือก ที่ มี ประสิทธิภาพ และ ถูก ต้อง ถึง ระดับ พันธุ กรรม
โดย : โกสินทร์  เมื่อ : 11/04/2004
เอกสารอ้างอิง : http://web.ku.ac.th/schoolnet/snet4/genetics/pcr.htm